Sorodstvo lahko dokažejo celo brez DNK očeta ali matere

Pred nedavnim so v genetskem laboratoriju na Inštitutu za sodno medicino ljubljanske medicinske fakultete (ISM), ki se ukvarja s forenzično genetiko že vse od leta 1996 in je opremljen z najsodobnejšo opremo za molekularne genetske preiskave, identificirali v balonarski nesreči zooglenela trupla. Na dan našega obiska so ravno prejeli zahtevo s sodišča, naj morebitne biološke sledi na poslanih predmetih, ki so jih našli na kraju ropa, primerjajo z DNK osumljenca. A tokrat smo preverili, kako dokazujejo sporno očetovstvo. Podrobno določen protokol, nepoučenim ljudem težko razumljivi znanstveni postopki, natančno označena, popisana in arhivirana dokumentacija – ob vsem skupaj je skoraj nemogoče podvomiti o verodostojnosti opravljenih analiz.

Brez pisne vloge s točnimi osebnimi podatki ter lastoročnimi podpisi, ki potrjujejo soglasje za sodelovanje v preiskavi, ne gre, vendar dobršen del testov preverjanja spornega očetovstva – na inštitutu jih prejmejo v povprečju pet na mesec – odredijo slovenska sodišča. V nasprotju z nekaterimi laboratoriji v tujini (tudi tistim, v katerem je svoj vzorec DNK oddal kardinal Rode) v ljubljanskem zahtevajo, da so na odvzemu – o uri in datumu sodišča obvestijo mesec dni prej (na zahtevo strank v zasebnih primerih se lahko ta rok skrajša) – v njihovi ambulanti hkrati navzoči vsi preiskovanci – da bi se izognili morebitnemu sumničenju o zamenjavi oseb ali vzorcev.

Dodatna varovalka je navzočnost zdravnika in višjega laboratorijskega tehnika, ki jima preiskovanci z osebnimi dokumenti izkažejo identiteto, po odvzemu vzorcev pa podpišejo obrazec, na katerega lahko napišejo tudi morebitne pripombe glede odvzema sline oziroma brisa ustne sluznice z vatirano palčko in krvi iz prsta. Višji laboratorijski tehnik vzorce natančno označi in jih začne pripravljati za analizo. S tako imenovane FTA-kartice, kartončku podobnega pripomočka, ki omogoča kakovostno shranjevanje krvi oziroma vzorcev DNK v suhem prostoru, izreže košček pri odvzemu nakapane krvi, prav tako del vate s palčke. Koščkom v epruveti doda reagente in encim za razgradnjo celičnih in jedrnih membran, s posebno napravico vse pretrese in segreje na temperaturo 56 stopinj Celzija, pri kateri encim najbolje deluje, in vzorce nekaj časa inkubira. Tako se odprejo vrata v celico, omogoči se dostop do DNK, v kateri je zapisano vse, kar nas definira, vse, kar smo. Nato v posebni napravi, Biorobotu, ekstrahirajo DNK iz vzorcev sline in krvi. Postopek so pred leti delali ročno, zdaj je avtomatiziran. DNK se veže na magnetne delce, spira z različnimi reagenti in se po približno 20 minutah popolnoma prečiščena izpere v epruvetko, pripravljena za analizo.

Zamenjava (tako rekoč) nemogoča

Ekstrahirani DNK najprej določijo količino DNK v vzorcu, nato pa forenzično informativne genetske označevalce jedrne DNK (ta vsebuje 22 parov nespolnih kromosomov, avtosomov, in en par spolnih kromosomov) s posebno reakcijo pomnožijo v milijon ali več kopijah. Za preverjanje sorodstvenih povezav preiskujejo področja STR, ki so individualno najbolj specifični odseki vijačnice. Med ljudmi so namreč tako zelo različna, da lahko s preiskavo večjega števila teh področij med seboj razlikujejo katerekoli osebe, razen enojajčnih dvojčkov, katerih dednina je identična. Ljudje se, kakor je povedala doc. dr. Irena Zupanič Pajnič, univ. dipl. biol., namestnica vodje v genetskem laboratoriju na ISM, med seboj razlikujemo v številu ponovitev osnovnega motiva preiskovanih področij STR, pri čemer imamo na vsakem od njih po dva tako imenovana alela (ena od oblik gena) – enega podedovanega od matere, drugega od očeta. Alele označijo s številkami, ki predstavljajo število ponovitev osnovnega motiva. Področja STR so nevtralna in ne dajejo informacij o fenotipskih lastnostih posameznika (na primer barva las, oči, ali je morebiti nagnjen k kakšnim boleznim …). »Edina fenotipska lastnost, ki jo opazujemo, je tista, ki daje informacijo o spolu preiskovanca,« je povedala Zupanič Pajničeva.

Po pomnožitvi večjega števila področij STR (preiskujejo 15 področij) in ločitvi pomnoženih produktov s kapilarno elektroforezo dobijo individualno specifičen alelni vzorec ali genetski profil (imenujejo ga tudi DNK-profil ali STR-profil) preiskovanih področij posameznika. Na ta način v laboratoriju določijo genetski profil posameznika – pri preverjanju spornega očetovstva torej matere in domnevnega očeta ter njunih otrok –, grafične prikaze (glej elektroferogram spodaj) pa nato primerjajo med seboj ter ugotavljajo, ali imajo skupen izvor. Za vsako področ­je STR določijo alel, ki ga je otrok podedoval po materi, nato pa preverijo, ali ima domnevni oče očetovski alel, ki je potreben za potrditev biološkega očetovstva. Tako lahko odgovorijo na vprašanje, ali je domnevni oče bio­loški oče otroka. »Očetovstvo potrdimo, ko je ujemanje očetovskih alelov prisotno na vseh 15 preiskovanih področjih, izključimo pa, ko so izključitve prisotne na vsaj treh analiziranih področjih STR,« je povedala med drugim tudi sodna izvedenka za genetske preiskave in preiskave sledi biološkega izvora ter ena največ­jih specialistk za identifikacijo žrtev povojnih množičnih grobišč.

Zahtevanih skoraj sto odstotkov

Brez statističnih izračunov skratka ne gre, potem ko izračunajo indeks očetovstva in naknadno verjetnost očetovstva – zahtevana verjetnost pri dokazovanju očetovstva mora biti kar 99,9-odstotna (na ISM ob uporabi kompleta s 15 področji STR večinoma dosegajo vrednosti, ki so višje od 99,999 odstotka) –, vse ugotovitve s podrobnim opisom in razlago rezultata preiskave zapišejo v izvedensko mnenje, ki ga posredujejo sodišču oz. vsem udeležencem preiskave, če je šlo za zasebno vlogo. »Rezultati genetskega testiranja so znani v približ­no dveh tednih,« je pojasnila Zupanič Pajničeva,

»Kadar se preverja očetovstvo za sinove, je dovolj, da se tipizira le otroka in domnevnega očeta, saj lahko v preiskavo ob prenizki verjetnosti za potrditev poleg avtosomalnih področij STR vključimo tudi preiskave kromosoma Y (ta se namreč v nespremenjeni obliki prenaša z očeta na sinove), pri hčerkah pa je prisot­nost oz. tipizacija mame zelo dobrodošla. Pri otrocih, ki niso polnoletni, je za preiskavo spornega očetovstva potrebna privolitev matere. Zgodi se, da za preiskavo ni na voljo nobenih bioloških vzorcev katerega od staršev. V primerih zapuščinskih razprav recimo preverjamo, ali so preiskovanci polbratje oziroma polsestre. Preverjanje sorodstvenih povezav včasih opravimo tudi brez očetovih bioloških vzorcev, a se zato v preiskavo vključi širše sorodstvo – priznani otroci in njihova mama ter nepriznani otrok z materjo. Tako lahko določimo alele, ki jih je otrok podedoval po očetu. Če je le mogoče, poskušamo pridobiti biološki material pokojnega očeta. Pri tem se obrnemo na razne bolnišnice, ki hranijo biološke vzorce, odvzete pacientom za različne diagnostične postopke. Ob odsotnosti očeta smo na primer uspešno potrdili primer polsestre, smo pa morali v preiskavo vključiti kar precej širšega sorodstva.«

Pomisleki in težave

Nekateri preiskovanci v sodnih postopkih pri testiranju očetovstva ne želijo sodelovati, pogosto se zgodi, da kdo od vabljenih na odvzem ne pride, tudi po večkrat ne, in tako vzorcev zaradi pravil ne odvzamejo nikomur od družinskih članov. Na inštitutu so imeli primer, ko ljudje rezultatom testa niso verjeli. »Vzorce krvi pri nas hranimo dve leti in v omenjenem primeru smo arhivirane vrnili, preiskovanci pa so genetski test ponovili v laboratoriju v tujini. Povratne informacije o rezultatih ponovne analize nismo dobili, kar seveda potrjuje naše delo.« Sogovornica meni, da težava najverjetneje tiči v tem, da se ljudje z rezultatom ne morejo sprijazniti, zato si morajo zadevo pri sebi v celoti razjasniti. »Ob ponovnem testiranju in pridobitvi enakih rezultatov se najverjetneje sprijaznijo z dejstvi.«

Poleg preverjanja bližnjih in daljnih sorodstvenih povezav na ISM opravljajo individualizacijo bioloških sledi v kriminalističnih primerih, identificirajo neprepoznavne posmrtne ostanke, preverjajo identiteto bioloških vzorcev ob sumu na njihovo zamenjavo, spremljajo uspeš­nost transplantacije kostnega mozga in se ukvarjajo z arheogenetskimi preiskavami skeletnih ostankov.

Uspešnost forenzičnih genetskih preiskav

Uspešnost in ne nazadnje hitrost forenzičnih genetskih preiskav je odvisna od kakovosti, količine in vrste bio­loškega materiala, ki je na voljo. Pri preverjanju očetovstva gre za kontrolirani odvzem, v kriminalistiki seveda ne, zato sta kakovost in količina DNK, pridobljene iz bioloških sledi – lahko so to krvni madeži, slina na cigaretnih ogorkih, vaginalni brisi ali madeži sperme po posilstvu, epitelijske celice kože pri kontaktnih sledeh … –, manjši. Pri identifikaciji posameznikov iz neprepoznavnih posmrtnih ostankov bo postopek krajši ob uporabi mehkih tkiv, če teh ni, so zelo uporabni nohti, drugače se lahko uporabijo kosti ali zobje, katerih obdelava pa je bistveno daljša. Pri skeletih, izkopanih iz povojnih množičnih grobišč in arheo­loških najdišč, morajo pridobljene genetske profile kosti primerjati z genetskimi profili vseh, ki so prišli v stik z izkopaninami (zaposleni v laboratoriju, tisti, ki so sodelovali pri izkopu in antropološki študiji – vsi ti so del eliminacijske podatkovne zbirke). S tem preverijo istovetnost genetskih profilov, pridobljenih iz kosti in zob. Primerjava z eliminacijsko podatkovno zbirko je potrebna tudi pri obdelavi bioloških sledi in drugih vzorcev, ki vsebujejo nizke količine DNK. Tudi zato, da ne puščajo svojih sledov, si morajo obiskovalci Laboratorija za molekularno genetiko ISM nadeti zaščitno ogrinjalo, rokavice, masko za usta in nos ter pokrivalo za lase.

Vse celice posameznika, pa naj bo v krvi, laseh, prhljaju, nohtih, poštnih znamkah, robčkih, zobeh, kosteh, cigaretnih ogorkih, maskirnih kapah, semenski tekočini, tudi v urinu in iztrebkih, imajo identično dednino, tako da so vse enako informativne, zaplete se le, če zaradi starosti in razgrad­nje ter premajhnih količin biološkega materiala ni mogoče priti do jedrne DNK. Takrat se je treba lotiti analize mitohondrijske DNK (pridobijo jo iz mitohondrijev v celični tekočini), ki se v celici nahaja v številnih kopijah, kar ji omogoča daljšo ohranitev, zato jo je mogoče preiskovati tudi, ko je preiskava jedrne DNK neuspešna. Mitohondrijska DNK se deduje po materi in se v nespremenjeni obliki prenese na vse potomce ne glede na spol, zato je zelo uporabna pri preučevanju družinskih rodovnikov in identifikaciji zgodovinskih osebnosti, saj se lahko za primerjavo uporabi tudi več generacij oddaljene sorodnike po materini liniji. Je pa postopek preiskave mitohondrijske DNK bistveno bolj zamuden od preiskave jedrnega genoma in zato tudi dražji.

Pomikanje (etničnih) meja

To metodo pogosto uporabijo tudi pri identifikaciji žrtev v slovenskih povojnih množičnih grobiščih. »Problem druge svetovne vojne je v tem, da je precej oddaljena in je zato malo še živečih bližnjih sorodnikov. Da dosežemo verjetnosti, ki so zahtevane za pozitivno identifikacijo, je treba še živeče bližnje sorodnike kombinirati z daljnimi ter uporabiti čim večje število genetskih označevalcev (poleg kromosoma Y in mitohodrijske DNK še čim večje število jedrnih področij STR).« So pa kosti dokaj nehvaležen material za pridobivanje DNK, predvsem je veliko daljša predpriprava vzorca za analizo. Vzamejo na primer del kosti, jo v komori očistijo, zbrusijo površinsko kontaminacijo, pri čemer ves čas uporabljajo tekoči dušik, da preprečijo pregrevanje, nato kost s kladivom razbijejo na manjše koščke in v posebni napravi zdrobijo v prah. Šele nato se po demineralizaciji iz prahu ekstrahira DNK. Na ta način so svetovno odmevno genetsko obdelali in uspešno identificirali 32 od skupno 88 žrtev iz grobišča Konfin 1, s čimer so dokazali, da je mogoče z genetiko priti do odgovorov tudi v primerih časovne oddaljenosti ali slabe ohran­jenosti biološkega materiala.

In genetika čedalje bolj premika meje, zlasti če pomislimo, da sekvenciranje oz. ugotavljanje zaporedja osnovnih gradnikov molekule DNK celotnega človeškega genoma stane »pičlih« tisoč dolarjev. »Sekvenciranje celotnega človeškega genoma za potrebe forenzičnih preiskav bi lahko vodilo do zlorab genskih informacij posameznika (na primer razkritje mutacij v genu za nastanek raka na dojki), zato nas zagotovo čakajo še številne razprave o množici etičnih zadržkov,« meni sogovornica.

»Čedalje več je znanega o genih za pigmentacijo kože, las, oči in na Nizozemskem zakonodaja za kriminalistične primere že dovoljuje določanje barve oči iz bioloških sledov. Pričakovano je, da se bo v prihodnje zakonodaja še spreminjala, predvsem z namenom, da bo dovoljeno iz analize bioloških sledi razbirati še barvo kože in las, sicer pa se veliko raziskuje v smeri določanja kronološke starosti – koliko je bil star človek, ki je pustil sled –, ugotavljanja telesne višine, obraznih karakteristik. Čez nekaj let ali desetletje po mojem lahko pričakujemo, da bodo preiskave v kriminalistiki res omogočale vizualizacijo, ustvarjanje fotorobotov osumljencev, ta korak naprej pa seveda pomeni, da bo genetsko raziskovanje v forenziki z nevtralnih odsekov genoma, ki jih proučuje danes, prešlo tudi na pre­iskovanje kodogenih regij, ki določajo vidne karakteristike posameznika,« napoveduje strokovnjakinja Irena Zupanič Pajnič.