Skrivnosti imunskega odgovora na okužbe

Vsi imamo prirojen imunski odgovor, ki ga poznamo kot vnetje. Njegovo aktiviranje sproži pridobljen imunski odziv.

Objavljeno
01. junij 2017 14.05
Mojca Benčina, Roman Jerala
Mojca Benčina, Roman Jerala
Okolje je polno nevarnih mikroorganizmov, kot so bakterije in virusi, pred katerimi se moramo zaščititi, če želimo preživeti. Pred okužbami se naše telo brani na več načinov. Poleg mehanske pregrade, kot so koža in telesne tekočine, je za zaščito pred okužbami ključen imunski sistem. Ob okužbi z nevarnimi mikroorganizmi se najprej sproži prirojen imunski odgovor, ki ga dedujemo ter je bolj ali manj enak pri vseh ljudeh. Kako deluje?

Bakterije in viruse prepoznajo receptorji prirojene imunosti. To so proteini, ki prepoznavajo molekule, značilne za mikroorganizme in ob vezavi aktivirajo prirojeni imunski odgovor, ki ga poznamo kot vnetje. Znake vnetja je opisal že starorimski enciklopedist Celzus kot »calor, dolor, rubor, tumor«, torej vročina, bolečina, rdečina in oteklina.

Aktivacija prirojenega imunskega odgovora v nadaljevanju spodbudi tudi pridobljen imunski odgovor, kar vodi do tvorbe obrambnih celic in protiteles proti mikroorganizmu, ki je okužbo povzročil. Protitelesa zagotavljajo dolgotrajno spominsko zaščito, ki se lahko aktivira ob ponovni okužbi z mikroorganizmom, proti kateremu so protitelesa nastala. Kombinacijo aktivacije prirojenega in pridobljenega imunskega odgovora s pridom izkoriščamo ob cepljenju.

Poldrugo desetletje raziskav

Na Kemijskem inštitutu na Odseku za sintezno biologijo in imunologijo že poldrugo desetletje raziskujemo skrivnosti prirojenega imunskega odgovora. Kmalu po odkritju prvega izmed receptorjev družine Toll (Tollu-podobni receptorji, s kratico TLR) leta 1996 in njegove vloge v aktivaciji imunskega odgovora, za kar je bila leta 2011 podeljena Nobelova nagrada v medicini, je sledilo odkritje, da sta prirojeni in pridobljeni imunski odziv tesno povezana. S tem so raziskave postale zanimive za farmacijo, saj so prepoznali pomen aktivatorjev prirojenega imunskega odziva pri pripravi modernih cepiv ter v imunoterapiji raka.

Za naše raziskave prirojene imunosti so najbolj zanimivi Tollu podobni receptorji, to so membranski proteini, ki prepoznavajo molekule značilne za mikroorganizme, ki povzročajo bolezni. Njihovo vlogo lahko primerjamo s čuvajem, ki sproži alarm, če prepozna vsiljivce, kar pomeni vdor mikroorganizmov. Naše raziskave na tem področju so se začele pred 15 leti, ko smo začeli raziskave receptorja TLR4, ki prepoznava lipopolisaharid Gram-negativnih bakterij.

V zadnjem času nas sicer zanima predvsem vloga tega receptorja v povezavi z boleznimi, kjer ni okužbe z bakterijami, zato pa ta receptor prepoznava lastne lipidne molekule, spremenjene zaradi oksidativnega stresa, o čemer smo poročali v odmevnem članku v reviji Science Signaling pred dvema letoma. Receptorji TLR sprožijo signal za nevarnost, ki ne preti nujno samo od mikroorganizmov, ampak imajo vlogo tudi pri aterosklerozi, artritisu, raku in večini drugih vnetnih bolezni.

Zanimivo je, da receptorji TLR prepoznavajo tudi nukleinske kisline, ki pa so tudi v naših lastnih celicah. Za prepoznavanje nukleinskih kislin so zadolženi kar štirje od enajstih človeških receptorjev TLR. Postavlja se torej vprašanje, kako receptorji TLR vedo, da gre za nukleinske kisline mikroorganizmov, in ne za naše lastne?

Prva razlika je pri ribonukleinski kislini – RNK, ki je v naših celicah večinoma v enoverižni obliki, medtem ko pri razmnoževanju virusov nastaja tudi dvoverižna oblika. Prav takšno obliko, torej dvoverižno RNK, prepoznava receptor TLR3, ki tako sporoča, da je nastala okužbe z virusi.

Mehanizem razlikovanja virusne in naše RNK smo pojasnili leta 2008, kar je predstavljalo našo prvo veliko objavo v vrhunski reviji Nature Structural and Molecular Biology. Raziskave smo razširili še na Tollu podoben receptor 9 (TLR9), ki prepoznava bakterijsko ali virusno DNK. V nasprotju z RNK večina DNK v naših celicah nastopa v obliki dvojne vijačnice, zato pa ta TLR9 prepoznava enoverižno DNK. Tudi v bakterijah je večina DNK v dvovijačni obliki, vendar nastanejo krajši fragmenti enoverižne DNK ob razgradnji bakterij, ko požrejo človeške celice. Vezava daljših kosov enoverižne DNK na receptor TLR9 sproži vrsto celičnih sprememb, ki so ključne za aktivacijo prirojene in pridobljene imunosti.

Obstaja še pomembna dodatna razlika med človeško in bakterijsko DNK. Večina človeške, ne pa bakterijske DNK, je encimsko spremenjene (metilacija) na citozinu v dinukleotidnem zaporedju CpG (citozin-gvanin). Receptor TLR9 zato prepoznava samo enoverižno DNK, ki ni metilirana, s čimer sporoča, da je celica prepoznala bakterijsko ali virusno okužbo in sproži alarm v sosednjih celicah, da se pripravijo na obrambo pred okužbo.

V pred kratkim zaključeni raziskavi smo pokazali, da mora aktivacijska DNK vsebovati vsaj dva zaporedna motiva dinukleotidov CpG na ustrezni medsebojni oddaljenosti, da lahko aktivira človeški receptor TLR9, medtem ko za aktivacijo mišjega receptorja TLR9 zadošča že enojni motiv CpG. V sodelovanju z raziskovalci Univerze v Tokiu smo dokazali, da so za opisano razlikovanje med mišjim in človeškim receptorjem odgovorni trije aminokislinski preostanki receptorja TLR9. Z raziskavo smo pojasnili nekatere neznanke v mehanizmu aktivacije receptorja TLR9, ki so pomembne pri pripravi sintetičnih aktivatorjev receptorja, kar je zelo pomembno za pripravo cepiv in imunoterapevtikov.

Poleg zaščitne vloge receptorja TLR9 velja omeniti, da lahko izjemoma razlikovanje med bakterijsko in lastno DNK odpove, tako da se receptor TLR9 aktivira zaradi lastne DNK, kar lahko vodi v nastanek avtoimunih obolenj, kot sta lupus in revmatoidni artritis. Za zdravljenje so zanimive tudi spojine, ki zavirajo delovanje receptorja TLR9.

Že dolgo preden smo sploh vedeli, da obstaja receptor TLR9, so v medicini za zdravljenje avtoimunih obolenj uporabljali antimalarike, kot je klorokvin. V naših raziskavah smo pojasnili, da se spojine, ki jih sicer uporabljamo za zdravljenje malarije, vežejo na DNK ter tako zmanjšajo vezavo lastne DNK na receptor TLR9 in zavirajo vnetje. Poročilo o tem odkritju, ki smo ga objavili leta 2011 v reviji Journal of Immunology, je bilo deležno velikega odziva in drugi raziskovalci so ga do zdaj citirali že več kot dvestokrat.

Kratki koščki razgrajene DNK okrepijo imunski odgovor

Naše zadnje odkritje na področju raziskav receptorja TLR9, ki smo ga pred kratkim objavili v reviji Nature Communications, je prav tako neposredno povezano z aktivacijo receptorja TLR9 in pomembno dopolni sedanje znanje o njegovem delovanju. Odkrili smo, da zelo kratki koščki DNK, ki so v celicah, okrepijo imunski odgovor na bakterijsko DNK.

Govorimo o zelo kratkih razgradnih koščkih DNK, dolgih dva do pet nukleotidov, ki pa morajo vsebovati dinukleotid CpG. Travma, rakava obolenja in bakterijske okužbe močno povečajo koncentracijo razgrajene DNK v telesu. Ti kratki fragmenti DNK sami po sebi ne sprožijo imunskega odgovora in so za imunski odziv nevidni. V kombinaciji z daljšimi fragmenti DNK, dolgimi okoli 20 nukleotidov, ki že sami po sebi lahko sprožijo aktivacijo TLR9, pa kratki koščki DNK občutno okrepijo imunski odgovor. To je bilo zelo nepričakovano, res pa so podobno opazili pri receptorjih TLR7 in TLR8 za prepoznavanje RNK.

Pomembno je, da mešanica kratkih koščkov in daljše enoverižne DNK izboljša imunski odgovor, kar posledično lahko izboljša učinkovitost cepiv.

V tem kontekstu se lahko spet navežemo na razvoj novih zdravil, kjer raziskovalci in farmacevtska industrija iščejo čim boljše rešitve, tako pri pripravi cepiv kot zdravil proti raku na podlagi aktivacije imunskega odziva. Dodatek kratkih koščkov DNK bi lahko pomembno izboljšal učinkovitost zdravil, ki temeljijo na aktivaciji receptorjev prirojene imunosti.

Receptor TLR9 je iz farmacevtskega vidika eden pomembnejših receptorjev, saj je priprava aktivatorjev receptorja TLR9, tako imenovanih aktivacijskih in kratkih fragmentov DNK, preprosta in poceni. Dejansko se danes sintetična DNK, ki je sposobna aktivirati receptor TLR9, že uporablja kot registrirana sestavina zdravil za terapijo določenih vrst raka in je bila uporabljena v kliničnih testih cepiv proti tuberkulozi, malariji, virusu gripe in hepatitisa B. Na podlagi našega znanja s področja prirojene imunosti smo na začetku leta podpisali pogodbo z mednarodnim farmacevtskim podjetjem za razvoj novih načinov izboljšanja cepiv.

Nujni so odlični raziskovalci in oprema

Vrhunsko raziskovalno delo si je težko predstavljati brez dobrih raziskovalcev in ustrezne opreme. Odsek za sintezno biologijo in imunologijo Kemijskega inštituta že več let načrtno vzgaja in izobražuje mlade kadre ter jih uspešno vključuje v raziskovalno delo.

Veliko naših študentov se je zaposlilo v farmacevtski industriji. Tudi več projektov na tekmovanjih iz sintezne biologije iGEM je bilo povezanih z imunologijo, na katerem smo študentom ponudili znanje in tehnologijo na svetovni ravni, s katerima so lahko pripravili izvrstne projekte.

Posledice zmanjšanja sredstev za raziskave, izobraževanje doktorandov in naložb v opremo krepko občutimo, saj smo morali kljub doseganju izjemnih dosežkov zaradi zmanjšanega financiranja prekiniti sodelovanje z več sodelavci. Težko je predvideti, kaj to pomeni dolgoročno. Že zdaj pa je jasno, da manj glav in rok upočasni raziskave, kar na tako kompetitivnem področju, kot je imunologija, pomeni zaostajanje za najboljšimi.

Nekateri najboljši študentje, med njimi tudi prva avtorica zgoraj opisanih raziskav dr. Jelka Pohar, so odšli na podoktorsko izobraževanje v tujino, kar je gotovo odlično za njihov znanstveni razvoj, za Slovenijo pa le, če jih bomo zmogli in želeli pritegniti nazaj.

Poleg usposabljanja moramo poudariti tesno odvisnost med dosežki in raziskovalno opremo. Brez sodelovanja v Centrih odličnosti (ENFIST), ki je bila edina večja investicija v napredno raziskovalno opremo v zadnjem desetletju v Sloveniji, nam ne bi uspelo opraviti omenjenih raziskav. Žal se naša oprema stara in tako izgubljamo konkurenčnost v mednarodni raziskovalni sredini.

Veliko raziskav sicer opravljamo prek sodelovanja s sodelavci iz tujine in z dostopom do evropske infrastrukture (iNext), vendar bi morali imeti v Sloveniji nekatere ključne raziskovalne instrumente, kot je, na primer, krioelektronski mikroskop, ki je v zadnjem desetletju pomenil izjemen preboj pri študiju bioloških sistemov in ni več redek niti v vzhodni Evropi.

Skrajni čas je, da v Sloveniji naredimo strateški razmislek in sprejmemo odločitev za uvedbo programa investicij za prihodnost, za podpiranje odličnosti, kot ga poznajo tako v zahodnih (na primer »Programme d'investissement d'avenir«, »Exzellenzinitiative«) kot tudi v nekaterih vzhodnoevropskih državah, kot sta Češka in Poljska, ne glede na to, katera stranka vlada. Tako bomo tudi v Sloveniji vzpostavili plodno okolje za najboljše kadre, ki bodo s pridobljenim znanjem oplajali družbo ter Sloveniji zagotavljali mesto med inovativnimi in bogatimi državami.