Tiskane izdaje
Še več, to znanje je nujno za razumevanje bioloških procesov in s tem dogajanja v organizmih, tako v normalnem stanju kot v primeru bolezni. Posledično nam omogoča načrtovanje zdravil in tudi drugih biotehnoloških izdelkov, kot so biosenzorji, naprave za sekvenciranje DNK in proteinov, dostavni sistemi zdravil, biološki insekticidi itd. Da lahko vidimo podrobnosti v zgradbi molekul, pa moramo uporabiti zelo močno, večstotisočkratno povečavo.
Navaden svetlobni mikroskop ni dovolj, ampak moramo uporabiti mikroskop, kjer vidno svetlobo zamenja energetsko močni žarek elektronov.
Elektronska mikroskopija je pustila zelo pomemben pečat v celični biologiji, saj z elektronskimi mikroskopi dobimo vpogled v različne celične strukture, lahko opazimo mitohondrije, membrane, vendar se je do pred nekaj desetletji tu ustavilo. Namreč, zgradbe molekul in molekulskih kompleksov z elektronskim mikroskopom jim ni uspelo določiti, ker elektroni ob trku v molekule le-te premaknejo in poškodujejo, zato so bile vse slike bioloških molekul zamegljene.
Krioelektronski mikroskop
Za visoko ločljivost molekul so imeli strukturni biologi na razpolago samo tehniki rentgenske kristalografije in jedrske magnetne resonance, ki pa imata tako prednosti kot slabosti. Rentgenska kristalografija zahteva pripravo kristalov molekul, kar pa ni vedno mogoče, včasih pa niti ni zaželeno, še posebno kadar želimo opazovati dinamiko bioloških molekul. Kristalografija je sicer še vedno zlati standard v strukturni biologiji, saj omogoča določevanje zgradb tako majhnih kot velikih bioloških molekul, vendar izgubi moč pri res ogromnih makromolekulskih kompleksih, ki jih najdemo v celicah organizmov, predvsem takih, ki so zasidrane v membrane.
Tudi jedrska magnetna resonanca je že uveljavljena in zelo uporabna strukturna metoda, ki ne zahteva priprave kristalov. Njena velika prednost je, da omogoča opazovanje dinamike molekul. Njena velika slabost pa je, da lahko opazujemo samo relativno majhne molekule, nikakor pa ne moremo meriti velikih objektov, kot so ribosomi, ionski kanalčki ali drugi molekulski stroji.
Najbolj »vroča« tehnika
Ključna prednost krioelektronske mikroskopije je, da lahko določamo zgradbo molekul v zelo širokem velikostnem območju. Vsekakor je krioelektronska mikroskopija edinstvena metoda za določevanje zgradb velikih bioloških molekul oziroma njihovih kompleksov, kjer rentgenska kristalografija in jedrska magnetna resonanca odpovesta. In, kar je zelo pomembno, omogoča proteinom, da ostanejo v procesu meritev blizu njihovega naravnega stanja, kar omogoča verodostojnejši vpogled v njihovo funkcijo. Danes s to tehniko že v veliko primerih vidimo položaje posameznih atomov. To pomeni, da lahko gledamo tudi vezavo majhnih molekul na biološke tarče.
Zaradi vseh teh prednosti krioelektronske mikroskopije so vse uspešne svetovne raziskovalne inštitucije, ki se ukvarjajo z vedami o življenju, že pred leti začele ustanavljati infrastrukturne centre, kjer so nameščeni zmogljivi mikroskopi ter zaposleni usposobljeni raziskovalci, ki to infrastrukturo upravljajo. V veliko primerih lahko že določimo položaje posameznih atomov. To pomeni, da lahko določimo tudi vezavo majhnih molekul na biološke tarče.
Ker je razvoj znanosti zdaj zelo hiter in konkurenčen, potrebe in zahteve v medicini in farmacevtski industriji pa velike, si nobena resna raziskovalna ustanova ne more več privoščiti, da ne bi imela krioelektronskega mikroskopa, če želi v korak s časom.
Preboji, ki so privedli
Richard Henderson iz MRC v Cambridgeu, VB, je prvi poročal o uporabi elektronske mikroskopije na zamrznjenih proteinskih vzorcih, s čimer je lahko rekonstruiral njihovo zgradbo. Slike bioloških molekul z elektronskega mikroskopa imajo zelo slab kontrast, ker atomi, ki sestavljajo biološke sisteme, slabo sipajo elektrone. To lahko izboljšamo tako, da analiziramo in povprečimo slike velikega števila delcev, tipično več 10.000, in s kombinacijo slik posameznih delcev, ki so različno orientirani v zamrznjenem vzorcu, rekonstruiramo tridimenzionalno zgradbo, pri čemer je imel ključno vlogo nagrajenec Joachim Frank z univerze Columbia v New Yorku, ZDA, ki je razvil programska orodja za rekonstrukcijo strukture.
Pomemben del priprave vzorcev je proces zamrzovanja, kjer se moramo izogniti tvorbi ledu, ki zaradi svoje periodične strukture lahko močno sipa elektrone. To lahko dosežemo z zelo hitrim zamrzovanjem vzorca, v nekaj milisekundah, zato se voda ne more urediti v led, ampak ostane v amorfni strukturi, rečemo, da vodo vitrificiramo, ker postane podobna steklu in ne moti kontrasta; biološke molekule, ki nas zanimajo, pa zamrznejo v različnih orientacijah in konformacijah, na podlagi česar lahko določimo njihovo strukturo in dinamiko. Tretji član nobelove kemijske trojke za leto 2017 Jacques Dubochet z univerze v Lozani v Švici je priznanje prejel za razvoj tehnik za hitro zamrzovanje vzorcev.
Kaj med nagrajenci manjka?
Po pravici povedano med nagrajenci manjka element, ki je ključno pripomogel k pravi revoluciji uporabe krioelektronske mikroskopije od leta 2003, za kar gre zasluga novi generaciji direktnih detektorjev elektronov, ki so izjemno hitri, občutljivi ter z zelo malo šuma. Podobno tehnologijo detektorjev so že prej uporabljali astronomi, v krioelektronski mikroskopiji pa je omogočila reševanje problemov, ki so se desetletja upirali rešitvi.
Zaradi velike hitrosti detektorjev lahko posnamemo ne le eno sliko, ampak kar film, s katerim lahko spremljamo, kako se molekule premikajo zaradi delovanja elektronov, kar nam izboljša kontrast.
Danes krioelektronska mikroskopija ni pomembna samo pri določevanju zgradb srednje velikih proteinov pri atomski ločljivosti, ampak še posebno zablesti pri molekulskih kompleksih, sestavljenih iz velikih ali gibljivejših molekul, ki nam jih ne uspe kristalizirati. Z krioelektronsko mikroskopijo lahko analiziramo tudi gibljivost in preurejanje kompleksov ter dobimo nekakšen film o dinamiki molekul. Znanstveniki razvijajo pristope za opazovanje poteka bioloških reakcij s pomočjo te edinstvene tehnike.
Bela lisa in Slovenija v njej
Krioelektronska mikroskopija je v veliko primerih edina razpoložljiva metoda za določanje zgradbe bioloških molekul, kar velja še posebno za membranske proteine, kot so mehansko-občutljivi ionski kanalčki in veliki sestavi, na primer jedrne ali toksinske pore, fotosintetski kompleks, kromatin, virusi in še veliko drugih. Ta zmogljivost tehnike je vzrok, zakaj se število krioelektronskih mikroskopov v raziskovalnih organizacijah povečuje z nezadržno hitrostjo.
Žal predstavlja področje južno od Dunaja, vzhodno od Milana ter celoten Balkan in s tem Slovenija z njim belo liso na zemljevidu institucij s tovrstno opremo. Sicer dobro poznamo kolege v soseščini, ki so pred kratkim kupili takšne instrumente. Od univerze v Milanu, Tehnične univerze v Münchnu, kjer je kolega, ki sodeluje v projektu Bioorigami, katerega vodimo na KI, nabavil kar dva krioelektronska mikroskopa za svojo skupino, do centralno-evropskega tehnološkega inštituta CEITEC v Brnu, ki ga je ustanovila država z dvestomilijonov evrov vredno investicijo, kar vključuje tri krioelektronske mikroskope, dodatna dva pa sta v nabavi. Najbrž ni treba posebej omenjati številnih odlično opremljenih institucij na 'Zahodu' in tudi desetin mikroskopov na Kitajskem.
Delno poskušamo pomanjkanje opreme za krioelektronsko mikroskopijo bioloških materialov nadomestiti s sodelovanjem in evropsko infrastrukturo, kjer je dostop do instrumentov zaradi velikega interesa zelo omejen. Na Kemijskem inštitutu je nekaj sodelavcev že usposobljenih za pripravo vzorcev ter procesiranje rezultatov krioelektronske mikroskopije, vendar bo treba nabaviti vsaj najpreprostejši krioelektronski mikroskop, ki stane od dva- do tri milijone evrov za osnovne analize vzorcev, sicer se bo konkurenčnost slovenske znanosti dodatno zmanjšala. Več področij raziskav na KI ter na več drugih raziskovalnih institucijah v Sloveniji, od analize virusov, membranskih por, dizajniranih proteinskih kletk in imunskih kompleksov predstavlja znanstvene probleme, kjer se krioelektronska mikroskopija predstavlja za najboljšo rešitev.
